Мобильная версия сайта Библиотека Здоровья - Большая медицинская библиотека
Поиск по сайту
Спросить доктора
Дарим книги!
Библиотека Здоровья - Большая медицинская библиотека

матка, яичник, маточная труба, яйцеклетка

Аутоантитела к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе у пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью. N- и  C- концевые эпитопы

S.Arif, R.Varela-Calvino, G.S.Conway, M.Peakman

J Clin Endocrinol & Metabolism, 2001, 86 (12):5892-5897

Преждевременная яичниковая недостаточность (ПЯН) - синдром, клинически определяемый как потеря яичниковой функции до 40 лет. Это гетерогенное расстройство с многофакторным патогенезом: хромосомные аномалии, генетические расстройства, нарушения обмена веществ, ятрогенные нарушения, инфекции. Однако у многих женщин этиология ПЯН до сих пор не известна, и для этих идиопатических случаев предположены аутоиммунные причины. Это предположение поддерживается гистологическими находками, демонстрирующими лимфоцитарную инфильтрацию яичников; присутствием аутоантител к антигенам яичников и сочетанием с другими аутоиммунными расстройствами. Антитела к стероидпродуцирующим клеткам (СПК-АТ), направленные напрямую против стероидных клеток коры надпочечников, теки интерны яичников, клеток Лейдига тестикул, плацентарного трофобласта - описаны при ПЯН с частотой встречаемости от 1 до 52%.

Ранее мы идентифицировали фермент стероидных клеток 3бета-гидроксистероид-дегидрогеназу (3бетаГСД) как аутоантиген при идиопатической ПЯН. Более того, у пациенток с ПЯН и аутоантителами к 3-бетаГСД имелся особый генотип HLA II класса - аспартатный остаток в 57 позиции бета-цепи DQ (HLA-DQb Asp57). Эта демонстрация связи генотипа HLA II класса с аутоантителами к 3-бетаГСД поддерживает гипотезу аутоиммунного происхождения некоторых форм идиопатической ПЯН, поскольку такая ассоциация типична для других аутоиммунных расстройств.

В нашем оригинальном исследовании уровень аутоантител к 3-бетаГСД определяли с помощью метода иммуноблот. Формат исследования определял некоторые ограничения. Во-первых, антиген денатурирован, таким образом только линейные эпитопы доступны для связывания аутоантител. Аналитическая чувствительность и специфичность могут быть снижены при потере конформационных эпитопов. Во-вторых, анализ является скорее качественным, чем количественным.        

Целью настоящего исследования было измерение уровня аутоантител методом иммунопреципитации меченного радиоактивным атомом нативного рекомбинантного 3бетаГСД, созданного в транскрипционно/трансляционной системе in vitro. Мы также постарались определить участки 3-бетаГСД, содержащие основные связывающие аутоантитела сайты.

Материал и методы исследования

В исследование было включено 100 пациенток с идиопатической ПЯН, обратившихся в Репродуктивную Эндокринологическую клинику в госпитале Миддлсекса (Лондон, Англия). Средний возраст 26 лет, разброс 11-39. ПЯН определяли как гипергонадотропную аменорею с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 20 МЕ/л двукратно. В нашей лаборатории верхнее референсное значение уровней ЛГ и ФСГ для женщин 11-29 лет составляет 10 МЕ/л, для женщин старше 30 лет - 15 МЕ/л. СПКЯ был исключен на основании клинических и ультразвуковых данных. Пациенты с ПЯН, развившейся вторично на фоне синдрома Тернера, химиотерапии, тазовой хирургии, облучения малого таза, галактоземии, генотипа 46,XY были исключены из исследования.

У 10 пациенток была первичная аменорея, у 90 - вторичная. Болезнь Аддисона исключали при клиническом обследовании, измерении электролитов сыворотки и с помощью пробы с синактеном. У 4 пациенток были аутоиммунные заболевания щитовидной железы, из них у 3 - гипотиреоз, получали лечение тироксином; у 1 - болезнь Грейвса.

В качестве контрольной  группы сыворотку брали у 103 здоровых доноров женского пола (средний возраст 27 лет, разброс 18-43г).

Клонирование 3-бетаГСД

кДНК для человеческого 3-бетаГСД амплифицировали с помощью Pfu полимеразы в ПЦР со следующими праймерами верхней и нижней полоски: 5’GCTCTAGAGCCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCCTTGTG 3’ и 5’GCTCTAGAGCTCACTGA GTCTTGGACTTCAGG 3‘, соответственно. Амплифицированный продукт обрабатывали XbaI и клонировали с pSP64 PolyA вектором. Для уточнения полученной последовательности проводили автоматический сиквенс с известными праймерами.

Формирование протеина люциферазы

кДНК человеческого 3-бетаГСД амплифицировали с помощью Pfu полимеразы в ПЦР со следующими праймерами верхней и нижней полоски: 5’GATCCTCATAAAGGCCATGGGCT GGAGCTGCCTTGTT3’ и 5’CCGCTCGAGTTAACCCACATGCACATCTC TGTC 3’, соответственно. Затем кДНК клонировали с ТОРО-ТА клонирующим вектором и обрабатывали EcoN1 и XhoI. Это вводило рамку считывания 3-бетаГСД в ген люциферазы в кодон 541, приводя к потере 9 терминальных кодонов люциферазы. Продукт pGEM-luc-3bHSD, его достоверность подтверждалась с помощью автоматического сиквенса.

Мечение эпитопов

Кроме введения целой молекулы 3бетаГСД в pGEM-luc, были созданы и клонированы в те же участки три фрагмента фермента, перекрывающиеся на 50 пар оснований: pGEM-luc-3bHSD1-450 (число отражает пары оснований, соответствует 1-150 аминокислотам 3бетаГСД), pGEM-luc-3bHSD399-849 (аминокислоты 133-283 3-бетаГСД) и pGEM-luc-3bHSD798-1116 (аминокислоты 266-372). Фрагменты получали с помощью ПЦР-амплификации с Pfu полимеразой оригинальной кДНК3-бетаГСД, используя следующие пары праймеров: 5’GATCCTCATAAAGGCATGGGCTGGAGCTHCCTTGT  3’ и 5’CC GCTCGAGTTAGTTTTCCAGAGGCTCTTCTTC3’; 5’GATCCTCATAAAGGCCTCCTACAAGGAAATCATCCA 3’ и 5’CCGCTCGAGTTAGGAATC AAGGCGGAGGCCG 3’; 5’GATCCTCATAAAGGCCAACCTTAATTACACCC TGAGC 3’ и 5’CCGCTCGAGTTAACCCACATGCACATCTCTCTGTC 3’. Все три фрагмента подтверждены с помощью автоматического сиквенса.

Транскрипция и трансляция 3бетаГСД in vitro

Все продукты были транслированы и помечены радиоактивной меткой с помощью системы транскрипции/трансляции на кроличьих ретикулоцитах. Трансляцию проводили соответственно инструкции производителя, метили протеины либо 35S-метионином, либо L-[4,5-3H]-лейцином в случае кДНК 3-бетаГСД, клонированной в pSP64, либо только 35S-метионином для продуктов pGEM-luc. Вектор pGEM-luc также транслировали и получали контрольный протеин, меченный 35S-метионином. Продукты трансляции изучали с помощью SDS-PAGE и ауторадиографии.

Радиоиммунопреципитация

Для каждого образца 17000-20000 cpm трансляционной смеси разводили до конечного объема 20 мкл в буфере для иммунопреципитации (10 ммоль HEPES (рН7,4), 0,5 ммоль метионина, 150 ммоль хлорида натрия, 10 ммоль бензамидина, 0.01% BSA, 0,5% Triton-X-114) и инкубировали с сывороткой до конечного разведения 1:5 в течение ночи при температуре 4С. 10 мкл Protein-A Sepharose (суспензия отмывалась дважды в буфере для иммунопреципитации и повторно разводилась в 0,5 мл буфера для преципитации на 1 мл Protein-A Sepharose) добавляли к каждому образцу и инкубировали при 4С в течение часа, встряхивая. Иммунные комплексы отмывали 5 раз в 0,5 мл буфера для иммунопреципитации, последнее отмывание производили в 0,5 мл стерильной воды, и анализировали с помощью SDS-PAGE и фосфовизуализатора. В каждый анализ добавляли контрольную кроличью антисыворотку к люциферазе и 3-бетаГСД. Также в каждый анализ добавляли сыворотку, позитивную по СПК-АТ и негативную контрольную сыворотку.

Количественный подсчет продукта иммунопреципитации с помощью фосфовизуализатора

Продукты преципитации разделяли в 10% SDS-PAGE, затем гель экспонировали в течение как минимум 48 часов, получали изображение, сканировали его и с помощью компьютерной программы измеряли интенсивность связывания.

Результаты

Выход меченого 3бетаГСД

В Табл. 1 показан средний уровень полученных меток. Выход протеина, меченного 35S, из системы транскрипции/трансляции с pSP64 был очень мал, давая недостаточное количество для иммунопреципитационного анализа. В целом мечение считается достаточным для иммунопреципитации, если число меток как минимум в 5-10 раз выше, чем в негативной контрольной реакции. Мечение протеина с помощью L-[4,5-3H]-лейцина так же было недостаточным.

Для решения проблемы малого выхода 3бетаГСД клонировали с люциферазой, белком, мечение которого в этой системе доказанно достаточное. Продукт 3-бетаГСД-люцифераза имел ожидаемый размер 103 кДа на SDS-PAGE и преципитировался как 3-бетаГСД, так и люцифераза-специфическими антисыворотками, что показывает, что антигенные эпитопы обоих протеинов доступны для антител.

Уровень аутоантител, определяемых иммунопреципитацией

Транслированная и меченная радиоактивным изотопом смесь люцифераза-3бетаГСД использовались для определения аутоантител методом иммунопреципитации. Радиоактивность, связанная с иммунопреципитацией, определяемая по сцинтилляции жидкости, недостаточно чувствительна для различения позитивной и негативной сыворотки. По этой причине использовали более чувствительный подход, при котором продукты преципитации разводили в 10% SDS-PAGE, сравнивали с помощью компьютерной пограммы и оценивали количественно в сравнении с негативной контрольной сывороткой.

У 12 пациенток (12%) с идиопатической ПЯН были положительны аутоантитела к 3бетаГСД в этом анализе.

 Ни одна из 103 контрольных сывороток не проявила какой-либо реактивности (рис.2), разница в частоте встречаемости аутоантител между пациентками и контрольной группой была достоверной (р<0,0001). Для убеждения в том, что реактивность была связана именно с 3бетаГСД, а не с люциферазной частью, все положительные образцы были протестированы с помощью иммунопреципитации на реактивность с люциферазой изолированно, и все тесты были негативными.

Сравнение методом иммунопреципитации и иммуноблота для определения уровня аутоантител к 3-бетаГСД

Ранее, используя метод иммуноблот, мы отметили присутствие аутоантител к 3бетаГСД у 25 из 118 (21%) пациенток с идиопатической ПЯН и у 5% здоровых лиц контрольной группы. Из этих 25 пациенток у 20 сыворотка была доступна для проведения метода иммунопреципитации. 14 из 20 сывороток, положительных при иммуноблоте, были негативны при иммунопреципитации, остальные же 6 сывороток были позитивны при обоих методах.

HLA-генотипы пациенток, позитивных по аутоантителам к 3-бетаГСД, определяемым методом иммунопреципитации

Система HLA представляет собой группу высоко полиморфичных генов на 6 хромосоме, вовлеченных в иммунную функцию. Ассоциации между аутоиммунными расстройствами, позитивностью по аутоантителам и подтипами HLA (например, ассоциация между HLA-DQ8, СД1, аутоантителами к декарбоксилазе глютаминовой кислоты) используются для подтверждения аутоиммунной природы заболевания. В наших предыдущих исследованиях генотип HLA-DQВ, кодирующий аспартат в позиции 57, был связан с ПЯН. В связи с этим мы обследовали частоту встречаемости этого генотипа в связи с аутоантителами, определяемыми новым методом.

Частота встречаемости HLA-DQb-Asp57 была проанализирована у 12 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД, определяемым методом иммунопреципитации. В этой когорте данные HLA были доступны у 11 из 12 пациенток, 10 из этих 11 (91%) были позитивны по генотипу HLA-DQb-Asp57, более того, 2 из 10 (20%) были по нему гомозиготны. Ранее, при использовании метода иммуноблот, 18 из 21 (85%) пациенток оказывались позитивны по генотипу HLA-DQb-Asp57. В контрольной популяции 92 пациентки из 134 (68%) были позитивны по генотипу HLA-DQb-Asp57, из них 13% гомозиготны. При анализе методом “хи-квадрат” частота встречаемости генотипа HLA-DQb-Asp57 достоверно не различалась между пациентками и контрольной группой.

Клинические характеристики пациенток, позитивных по аутоантителам к 3-бетаГСД

У 11 из 12 пациенток с аутоантителами к 3бетаГСД была вторичная аменорея, у 1 - первичная. Данные по тиреоидным и надпочечниковым аутоантителам были доступны у 11 из этих 12 пациенток. У 4 пациенток были тиреоидные аутоантитела ( у 1 к микросомам, у 1 к тиреоглобулину, у 2 оба вида антител), у 1 из них  были клинические признаки гипотиреоза.

Мечение эпитопов

Тот же метод, что описан выше, использовался для определения аутоантител к каждому из трех фрагментов 3-бетаГСД, связанного с люциферазой. Сыворотка была доступна у 9 из 12 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД.

На рис. 3 представлена реактивность каждого из трех фрагментов 3-бетаГСД с сывороткой пациенток с идиопатической ПЯН, позитивной по аутоантителам к 3-бетаГСД. Ни одна из сывороток не проявила какой-либо реактивности с фрагментом 2 (pGEM-luc-3bHSD399-849). 2 сыворотки (22%) проявили реактивность к фрагменту 1 (pGEM-luc-3bHSD1-450). 7 сывороток (77%) реагировали с фрагментом 3 (pGEM-luc-3bHSD798-1116).

Из 5 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД по результатам обоих методов, сыворотка одной показала реактивность с фрагментом 1 (N-концевым), 3 - с фрагментом 3 (С-концевым). Сыворотка одной пациентки реагировала с обоими фрагментами - 1 и 3.

Обсуждение

Целью настоящего исследования было определить аутоантитела к 3бетаГСД в сыворотке пациенток с ПЯН, используя количественный и чувствительный метод радиоиммунопреципитации. Дополнительной целью было определить, не сфокусирована ли реактивность избирательно на отдельных частях молекулы.

Вначале мы попытались пометить протеин 3бетаГСД, используя 35S-метионин, L-[4,5-3H]-лейцин и широко используемую для транскрипции/трансляции in vitro плазмиду pSP64. Однако ни один из этих методов не привел к получению достаточного количества меченного протеина. По этой причине кДНК 3бетаГСД связали с люциферазой, что привело к образованию большого количества меченного протеина, распознающегося обоими антисыворотками - и к 3бетаГСД и к люциферазе. Люцифераза была выбрана для связывания, поскольку она очень эффективно транслируется и связывается с метками в системе транскрипции/трансляции  in vitro. Это не первое исследование, где она так используется. Например, при болезни Грейвса, при которой антитела к рецептору ТТГ обычно присутствуют в низком уровне и с трудом определяются обычными методами, использование рецептора к ТТГ, связанного с люциферазой, в реакции иммунопреципитации дает положительные результаты, хорошо коррелирующие с уровнем связывания аутоантител, определяемым биохимическим анализом. Мечение 3бетаГСД с помощью 35S-цистеина не подходит для настоящего исследования, так как одной из его целей является идентификация эпитопа 3бетаГСД, предпочтительно связывающего сыворотку пациентов. Отсутствие остатков цистеина в С-концевом участке (аминокислоты 260-372) не позволяют нам использовать радиоактивный цистеин. И наоборот, используя связь с хорошо поддающимся меткам протеином (люциферазой) позволило нам определить аутоантитела к любому участку 3бетаГСД, независимо от его аминокислотного состава.

Метод иммунопреципитации связанного протеина збетаГСД-люциферазы привел к определению аутоантител к 3 бета-ГСД у 12% пациенток с идиопатической ПЯН и ни у одной из обследованных нами здоровых женщин. Эти результаты позволяют предположить, что метод иммунопреципитации имеет большую специфичность, чем метод иммуноблот, который мы использовали ранее, при котором были позитивны 5% контрольных сывороток. Сравнительные результаты исследования сывороток обоими методами выявляют низкую конкордантность между ними, что отмечают и другие исследователи. Самое доступное объяснение низкой конкордантности между методами иммунопреципитации и иммуноблота - это природа антигена в этих исследованиях. В иммуноблоте 3бета-ГСД денатурирован кипячением, выдержан с химическими денатураторами и связан с нитроцеллюлозой. Это разрушает вторичную и третичную структуру белка, оставляя линейную молекулу. Связывание аутоантител с линейной молекулой зависит от их способности связываться с определенной аминокислотной последовательностью (линейные эпитопы). При иммунопреципитации антиген имеет нативную конформацию, сохраняя свою вторичную и третичную структуры. Многие типы аутоантител способны связываться именно с конформационными структурами (конформационные эпитопы) и не связывают линейные антигены. Наши результаты позволяют предположить, что в случае определения аутоантител к 3бетаГСД, антитела, связывающие линейные эпитопы, и выявляемые методом иммуноблот, менее специфичны, чем те, что связывают конформационные эпитопы и определяются методом иммунопреципитации.

Предыдущие исследования показало более редкую встречаемость аутоантител к 3бетаГСД у пациенток с ПЯН, чем мы определили сейчас. Этот разброс скорее всего является результатом методологических различий. В частности, система для определения связывания в нашем исследовании, была - фосфовизуализатор, что более чувствительно, чем ауторадиография, использованная Reimand et al. Кроме того, имеются различия в характеристиках пациентов в разных исследованиях. В частности, в нашем исследовании пациентки были более молодыми. Интересно, что Reimand et al отмечали присутствие аутоантител к 3 бетаГСД у 20% пациентов с аутоиммунным полиэндокринным синдромом 1, но неизвестно, была ли у кого-то из этих пациентов яичниковая недостаточность.

У пациенток с аутоантителами к 3бетаГСД в настоящем исследовании наблюдалась сильная взаимосвязь с генотипом HLA-DQb-Asp57 - 90% по сравнению с 68% в контрольной популяции. Хотя эта разница статистически не достоверна, возможно причиной является недостаточная количественная выборка. Такие взаимосвязи между наличием аутоантител и определенным типом HLA-DQ наблюдается при других аутоиммунных расстройствах, таких как СД1, при которых аутоантитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты ассоциированы с генотипами DQ2/8 или DQ2/X. Взятые вместе, эти находки поддерживают вывод о том, что приблизительно 12% пациенток с идиопатической ПЯН имеют аутоиммунный патогенез своего заболевания. Однако в настоящее время не ясна роль аутоиммунитета к 3-бетаГСД в патогенезе заболевания. Дальнейшие исследования сконцентрированы на характеристиках аутоантител к этому фермент, но вряд ли аутоантитела сами собой вызывают повреждение ткани, поскольку 3бетаГСД также присутствует в тканях (например, кора надпочечников), не повреждающихся у пациенток с ПЯН. В настоящем исследовании мы использовали кДНК 3бетаГСД II типа как источник антигена, который в основном экспрессируется в надпочечниковой и яичниковой ткани. Возможно, что аутоантитела, которые мы определили, также перекрестно реагировали с вненадпочечниковым, I типом фермента, поскольку типы обладают 93% гомологией. Исходя из знаний о других аутоиммунных органоспецифических расстройствах, сопровождающихся аутоантителами к ферментам, дисфункция ферментативных процессов наблюдается редко.

Согласно результатам настоящего исследования, основной эпитоп для аутоантител к 3бетаГСД лежит в области аминокислотных последовательностей 1-150 и 266-372, участок 133-283 не обладает реактивностью. Все пациентки, положительные по аутоаттителам к 3-бетаГСД, демонстрируют реактивность по крайней мере к С- или N-концевой части. Возможно, что существуют другие эпитопы, но они непрерывны и требуют интактности молекулы. Другие исследователи отмечают, что иммунодоминантный регион молекулы 3бетаГСД находится в N-концевом участке, и настоящее исследование подтверждает этот вывод. Хотя каждый из фрагментов 3-бетаГСД преципитировал со специфичной к 3-бетаГСД антисывороткой, мы не можем исключить возможности того, что связь с люциферазой нарушает связывание с антителами и это приводит к сниженной реактивности N-концевого участка молекулы и к потере реактивности региона 133-283.

Заключение

Аутоантитела к 3бетаГСД могут определяться в сыворотке пациенток с ПЯН методом иммунопреципитации протеина, связанного с люциферазой, и реактивность выявляется напрямую против N- и С-концевого участков молекулы. Аутоантитела к 3-бетаГСД ассоциированы с определенным генотипом HLA-DQ. Это исследование демонстрирует необходимость более точных методом исследования для обеспечения конкордантности между различными исследованиями, чтобы повысить диагностическую и прогностическую ценности определения аутоантител к 3бетаГСД.

Перевод Малярской М.М.

 

Читайте также:

Аутоантитела к 3-бетагидроксистероид дегидрогеназе редко встречаются при преждевременной яичниковой недостаточности

Болезненность менструаций

Вульвовагинит: воспаление влагалища и наружных половых органов

Гарднереллез, "ключевые клетки"

Иммунология привычного невынашивания

Клиника вульвовагинитов. Лечение вульвовагинитов

Миома матки

Неудержание мочи

HELLP-синдром

Soor

Рахит

Рентгенография: легких, черепа

Рубец

Спинномозговая пункция

Сирингомиелия

Слюнная железа

Сон

Страх

Стресс, его влияние на здоровье

Судороги

Свищ, фистула

Солнечный микроб причина язвы

Состояние биоценоза кишечника у детей-реконвалесцентов ОКИ и пути коррекции

Патогенез, диагностика и хирургическое лечение патологического венозного дренажа кавернозных тел полового члена.

 

Поделиться или сохранить себе

Статьи
Лекарства
Безопасность лекарств

Рубрикатор по Мед2000.ru

Анализы

Акушерство

Аллергология

Андрология

Гастроэнтерология

Гематология

Гинекология

Дерматология

Диетология

Иглотерапия

Иммунология

Инфекции

Кардиология

Косметология

Неврология

Нефрология

Онкология

Оториноларингология (ЛОР)

Паразитология

Педиатрия

Психиатрия

Психология

Пульмонология

Ревматология

Сексология

Стоматология

Терапия

Урология

Фармакология

Хирургия

Эндокринология

Эпидемиология

Другие специальности

 

Энциклопедии

Вопросы и ответы

Анализы. Инфекции

Аллергии

Здоровый человек

Атопический дерматит

Секс

Термины

Материалы ВОЗ

Нетрадиционные методы

Сам себе 03

Прививки

Косметика

 

Лекарства

От А до Й

От К до Н

От О до С

От Т до Я

 

Психология

Рецепты

 

Врачу

Справочник врача

Научные статьи, тезисы, литобзоры, методички

Переводы

Скорая помощь

 

Рубрикатор: Анализы, Акушерство, Аллергология, Андрология, Гастроэнтерология, Гематология, Гинекология, Дерматология, Диетология, Иглотерапия, Иммунология, Инфекции, Кардиология, Косметология, Неврология, Нефрология, Онкология, Оториноларингология (ЛОР), Паразитология, Педиатрия, Психиатрия, Психология, Пульмонология, Ревматология, Сексология, Стоматология, Терапия, Урология, Фармакология, Хирургия, Эндокринология, Другие специальности:, Анестезиология Ангиология, Гепатология, Наркология, Нейрохирургия, Неонатология Ортопедия, Офтальмология, Проктология, Реаниматология, Травматология, Фтизиатрия,

Сайт Библиотека Здоровья - Большая медицинская библиотека - www.med2000.ru (до 1999г - www.gabr.org) создан в 1998 году

©Med2000.ru, Gabr.org

Правила копирования информации с сайта Мед2000 для использования в Интернет

Представленная на сайте информация не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения и не может служить заменой очной консультации лечащего врача.

Страницу лучше просматривать при среднем размере шрифта