Мобильная версия сайта Библиотека Здоровья - Большая медицинская библиотека
Поиск по сайту
Спросить доктора
Дарим книги!
Библиотека Здоровья - Большая медицинская библиотека

 

Определение ароматазы цитохрома Р450 в образцах эндометрия как диагностика эндометриоза

 

J.Kitawaki, I.Kusuki, H.Koshiba et al.

Fertility and sterility, vol.72,No.6, dec. 1996, p. 1100-1106.

           

Цель исследования: оценить клиническую значимость исследования уровня ароматазы цитохрома Р450 в биопсийных образцах эндометрия для диагностики эндометриоза.

            Дизайн исследования: ретроспективное, случай-контроль.

            Пациенты: у 105 женщин репродуктивного возраста с нормальным менструальным циклом проводили биопсию эндометрия при лапаротомии или лапароскопии. Гистологическое исследование выявляло эндометриоз, аденомиоз и/или лейомиому. Эндометрий пациенток с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний считался здоровым.

            Вмешательства:  биопсия эндометрия

            Исследования: определяли экспрессию ароматазы цитохрома Р450 методом  ПЦР (с обратной транскрипцией) и иммуногистохимического анализа. Распределение и интенсивность окрашивания оценивали с помощью полуколичественного коэффициента Н.

            Результаты: Присутствие ароматазы цитохрома Р450 обнаружено в образцах эндометрия женщин с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой и не обнаружено в образцах здоровых женщин (коэффициент Н менее 20), чувствительность - 91%, специфичность 100%.

            Заключение: экспрессия ароматазы цитохрома Р450 в образцах эндометрия здоровых женщин и женщин с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомы различается. Техника определения этого фермента может использоваться в клиниках по лечению бесплодия в качестве амбулаторной скрининговой поцедуры, выявляющей наличие эстроген-зависимой патологии.

            Эндометриоз часто сочетается с хронической тазовой болью и бесплодием. Диагностические процедуры, такие как трансвагинальное УЗИ и МРТ, могут использоваться для скрининга эндометриоза, но для  установления точного диагноза необходима лапароскопия или лапаротомия (1). Серологический анализ СА-125 используется для определения прогрессирования эндометриоза, но его применение для начальной диагностики ограничено (2). Необходим точный и простой диагностический тест на эндометриоз.

            Эндометриоз встречается у женщин репродуктивного возраста и регрессирует в менопаузе или после овариэктомии, что позволяет предположить эстроген-зависимость этой патологии. Рецепторы к эстрогенам, андрогенам и прогестерону определены методами гормон-лиганд - связывающего анализа (3) и иммуногистохимического анализа (4). Конверсия андрогенов в эстрогены происходит преимущественно в плаценте и яичнике и катализируется ароматазой, основным компонентом которой является ароматаза цитохрома Р450. Эстроген-зависимые заболевания матки, такие как карцинома эндометрия (5-7), эндометриоз (8,9), аденомиоз (10,11) и лейомиома (12,13) сочетаются с повышенной активностью ароматазы и экспрессией мРНК ароматазы цитохрома Р450. Это позволяет предположить, что ткани продуцируют эстрогены, которые могут отвечать за их патологический рост, взаимодействуя со своими рецепторами.

            Предыдущие исследования нашей лаборатории (9) показали, что мРНК ароматазы цитохрома Р450 и сам фермент экспрессируются в эндометрии пациенток с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой, и не экспрессируются в эндометрии менструирующих женщин с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний. Эти находки показали, что хотя эндометрий пациенток с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой внешне похож на эндометрий здоровых женщин, метаболизм эстрогенов в эндометрии этих групп пациенток значительно различается. Эндометриоз, аденомиоз и лейомиома - это отдельные состояния, но у них сходная патофизиология, они развиваются у женщин репродуктивного возраста, их прогрессирование эстроген-зависимо. Аденомиоз и лейомиому сравнительно легко диагностировать с использованием визуализационной техники, а легкий или бессимптомный эндометриоз достаточно трудно идентифицировать.

Целью настоящего исследования было определить клиническую значимость исследования образцов эндометрия на содержание ароматазы цитохрома Р450 в качестве диагностического теста на эндометриоз.

Материалы и методы исследования

Образцы ткани

Образцы эндометрия брали с диагностической целью у 105 женщин, подвергшихся лапаротомии или лапароскопии. Информированное согласие было получено от каждой пациентки.

Все пациентки были репродуктивного возраста (24-48 лет) и имели нормальные менструальные циклы. Пациентки не получали гормональную терапию (ни аналоги ГнРГ, ни даназол, ни КОК). Эндометриоз, аденомиоз и лейомиома были диагностированы при гистологическом исследовании удаленных маток (91 случай) или при исследовании биопсийных образцов (14 случай). Степень эндометриоза определялась по шкале Американского Общества Фертильности (1). Образцы эндометрия от пациенток с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний расценивались как нормальные. Из исследования были исключены пациентки со следующими диагнозами: злокачественные новообразования (кроме карциномы шейки матки in situ), опухоли яичников, воспалительные процессы в малом тазу, беременность.

Свежие образцы разделяли на три части: одну часть немедленно замораживали при температуре -80 градусов Цельсия и сохраняли для выделения общего количества РНК; две остальные части фиксировали в 4% параформальдегиде с добавлением буферного раствора 0,05М гидроксиметиламинометана гидрохлорида  (рН 7,6) при 4°С в течение 24 часов. Одну из этих порций подвергали гистологическому исследованию, а другую - иммуногистохимическому анализу. Образцы крови забирали до операции и определяли уровень сывороточного СА-125 иммунорадиометрическим методом с использованием специфических моноклональных антител м11 (Centocor, Malvern, PA).

Выделение РНК и ПЦР с обратной транскриптазой - Southern Blot

Общее количество РНК выделяли, как было описано ранее (9), используя тризол (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Первичный синтез комплементарной ДНК (кДНК) катализировали с помощью Superscript II RT (GIBCO BRL), используя олиго(дезокситимидин)12-18, полученную кДНК использовали для ПЦР амплификации, как описано ранее (9). Использовали праймеры 5’-TTGTTGTTAAATATGATGCC-3’ (прямой) и 5’-ATACCAGGTCCTGGCTACTG-3’ (обратный) для человеческой ароматазы цитохрома Р450 и амплаймерный набор для определения человеческой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (G3PDH) (Clontech, Palo Alto, CA).

ПЦР-образец состоял из 1 мкл первичной кДНК, 1мкМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозид 5’-трифосфатов (дНТФ), 2,5 Ед KOD Dash (Toyobo, Osaks, Japan), доведенных до общего объема 100 мкл ПЦР-буфером. Условия для ПЦР выдерживались  следующие: 94°С в течение 3 минут для денатурации гибрида РНК-кДНК; затем 40 циклов температурного режима 94°С по 30 секунд, 45°С (для ароматазы цитохрома Р450) или 55°С (для  G3PDH) - 2 секунды и 74°С - 30 секунд. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. Комплементарный образец 5’-TAATGATTGTGCTTCATTATGTG-3’ для ароматазы цитохрома Р450 и образец для G3PDH (Clontech) были помечены на 5’-конце с помощью АТФ с фосфором 32P. Мембрану гибридизировали с меченым образцом в течение ночи при температуре 55°С, и результаты исследовали на биоанализаторе (BAS 2000, Fujix, Tokyo, Japan).

Иммуногистохимический анализ

Образцы ткани фиксировали 4% раствором параформальдегида, заливали парафином и разрезали на пластины толщиной 4 мкм. Пластины отделяли от парафина и выдерживали в течение 5 мин в 3% растворе перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы, затем трижды отмывали с буферным раствором 0,05М гидроксиметиламинометана гидрохлорида  (рН 7,6), содержащим 0,05% Tween 20 (буфер для отмывки) и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с Dako Protein Block Serum-Free (Dako, Carpinteria, CA) для блокировали связывания неспефицических белков. Пластины инкубировали в течение 24 часов при 4°С с кроличьей антисывороткой к человеческой плацентарной ароматазе цитохрома Р450 (Pab R-8-2, 1:1,000), разведенной Dako Antibody Diluent (Dako). Характеристики специфической антисыворотки были описаны ранее (14).

Пластины отмывали трижды отмывочным буфером и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре Dako Envision - полимером с меченой пероксидазой, связывающимся с антикроличьими IgG (Dako). Далее пластины снова отмывали трижды отмывочным буфером, окрашивали раствором 3,3-диминобензидина гидрохлорида, а затем гематоксилином. Для положительного контроля присутствия ароматазы цитохрома Р450 использовали образцы человеческой плаценты. Для отрицательного контроля образцы инкубировали с неиммунизированной кроличьей сывороткой в том же разведении или Pab R-8-2, предварительно обработанной очищенной человеческой плацентарной ароматазой цитохрома Р450 (500 мкг ароматазы цитохрома Р450 на 1 мл разведенного Pab R-8-2) для блокирования активных участков связывания. Положительные и отрицательные контрольные образцы окрашивали точно так же и одновременно с каждой серией исследуемых образцов эндометрия.

Интенсивность окраски анализировалась с помощью полуколичественного коэффициента H (15). Его рассчитывали по следующей формуле:

H = SPi, где i - интенсивность окраски 0, 1, 2 или 3 (отрицательная, слабая, умеренная, сильная, соответственно), а P - процент окрашенных клеток при каждом значении i (от 0 до 100%, соответственно). Приблизительно 500 железистых клеток изучались в каждом образце для высчитывания коэффициента Н, его среднее значение  рассчитывалось как среднее арифметическое от двух значений, полученных двумя независимыми исследователями.

Статистический анализ

Различия коэффициента Н между группами определялись с помощью монофакторного вариационного анализа и множественных сравнений (процедура Sheffe). Персональные коэффициенты корреляции использовались для определения корреляции между сывороточным уровнем СА-125 и коэффициентом Н.

Результаты

Из 105 пациенток у женщин с эндометриозом (n=32) средний возраст пациенток составил 38,3±7,9 лет, индекс массы тела - 21,2±2,8 кг/м2; у женщин с аденомиозом - 42±6,5 лет и 2,2±3,1 кг/м2; у женщин с лейомиомой - 44,8±4,5 лет и 21,6±2,7 кг/м2; у женщин без гинекологических заболеваний (n=21) - 37,2±8,1 лет и 23,8±4,6 кг/м2, соответственно. Средний возраст пациенток с лейомиомой был выше, чем пациенток с эндометриозом (р < 0,001) и здоровых женщин (р < 0,001). Различий индекса массы тела между группами не было.

Southern blot для определения экспрессии мРНК ароматазы цитохрома Р450 осуществляли в каждом образце эндометрия, взятого для биопсии в течение менструального цикла. На рис.1 показано, что транскрипция ароматазы цитохрома Р450 определялась в образцах пациенток с эндометриозом, аденомиозом и лейомиомой, и не определялась в образцах нормально менструирующих женщин с отсутствием гинекологических заболеваний.

В попытке повысить чувствительность определения экспрессии ароматазы цитохрома Р450, в каждом биопсийном образце эндометрия был проведен иммуногистохимический полуколичественный анализ. Ароматаза цитохрома Р450 локализуется преимущественно в цитоплазме железистых клеток и очень слабо - в строме. Присутствие ароматазы цитохрома Р450 определялось в образцах эндометрия женщин с эндометриозом, взятых как в пролиферативную (рис. 2а), так и в секреторную фазы цикла (рис. 2в). Также определялась ароматаза цитохрома Р450 в обеих фазах цикла у женщин с аденомиозом и лейомиомой. В эндометрии нормально менструирующих женщин без гинекологических заболеваний ароматаза цитохрома Р450 не определялась ни в пролиферативную (рис. 2с), ни в секреторную фазу цикла (рис. 2d).

Интенсивность и распределение специфической окраски на ароматазу цитохрома Р450 оценивали полуколичественным методом с использованием коэффициента Н (Рис. 3). В образцах, полученных от пациенток с эндометриозом, аденомиозом, лейомиомой коэффициент Н широко варьировал. В 21 образце, полученном от женщин без гинекологических заболеваний, коэффициент Н был менее 20, менее среднего значения в остальных группах (р < 0,0001). Разницы значений коэффициента Н в разные фазы цикла не было (рис. 3).

Оптимальное значение чувствительности (91%) и специфичности (100%) достигалось при пороговой величине коэффициента Н=20, положительная прогностическая ценность этой величины составила 100%, отрицательная прогностическая ценность - 72%. Положительное значение ароматазы цитохрома Р450 определялось в 80% образцов эндометрия от женщин с заболеваниями, независимо от того, было у женщины одно или несколько заболеваний. В группе с отсутствием гинекологических заболеваний значение Н было отрицательным (Табл. 1).

Табл. 1.

Определение ароматазы цитохрома Р450 в образцах эндометрия

 

Число положительных результатов на ароматазу цитохрома Р450/число всех образцов в данную фазу цикла (%)

Заболевания

Пролиферативная

Фаза

Секреторная

фаза

Всего

 

Эндометриоз

7/7 (100)

4/5 (80)

11/12 (92)

 

Аденомиоз

5/5 (100)

6/7 (86)

11/12 (92)

 

Лейомиома

10/11 (91)

6/7 (86)

16/18 (89)

 

Эндометриоз+аденомиоз

2/2 (100)

2/2 (100)

4/4 (100)

 

Эндометриоз+лейомиома

5/5 (100)

4/5 (80)

9/10 (90)

 

Аденомиоз+лейомиома

8/10 (80)

12/12 (100)

20/22 (91)

 

Эндометриоз +аденомиоз +лейомиома

4/5 (80)

1/1 (100)

5/6 (83)

 

Отсутствие гинекологияеских заболеваний

0/8 (0)

0/13 (0)

0/21 (0)

 

Положительным считалось значение Н более 20.

Для определения корреляции между коэффициентом Н и тяжестью эндометриоза, коэффициент Н в образцах с эндометриозом исследовался как функция от степени эндометриоза (шкала Американского Общества Фертильности) или от сывороточной концентрации СА-125. Корреляции между этими величинами не обнаружено (r=0,87; r=0,045, p=0,82, соответственно).

Обсуждение

Некоторые исследования (16-21) описывали присутствие ароматазной активности и ее регуляции в нормальном эндометрии у женщин репродукитвного вораста. Однако некоторыми группами исследователей зафиксировано отсутствие экспрессии ароматазы в нормальном эндометрии при измерении каталитической активности (9, 22, 23), иммуногистохимическом анализе (9) и ПЦР с обратной транскриптазой (9, 24). Тщательный обзор этих исследований выявил, что образцы «нормального» эндометрия брались как правило после гистерэктомии, проведенной по поводу различных гинекологических заболеваний, включая эндометриоз, аденомиоз, лейомиому. Не были взяты образцы эндометрия из интактных маток.

Для прояснения ситуации мы жестко определили нормальный эндометрий как взятый у нормально менструирующих женщин с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний, и показали, что в нормальном эндометрии не присутствует ни ароматаза цитохрома Р450, ни ее мРНК (9). Мы также показали, что ароматаза цитохрома Р450 и ее РНК экспресируются в эндометрии пациенток с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой, так же как в эктопических участках эндометриоидной ткани 99).

Настоящее исследвоание подтверждает, что ароматаза цитохрома Р450 экспресируется в эндодметрии жнщин с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой, и не экспрессируется в образца эндометрия женщин с отсутствием гинекологических забоелваний. Высокая чувствительность (91%) и специфичность (100%) теста демонстрирует, что с помощью определения ароматазы цитохрома Р450 можно различать патологическую и здоровую ткани. При использовании в комбинации с визуализационными процедурами, иммуногистохимическое исследование ароматазы цитохрома Р450 способствует диагностике эндометриоза, аденомиоза и/или лейомиомы матки достаточно легко и с большой точностью. При исключении на УЗИ диагнозов аденомиоза, лейомиомы, новообразований и воспаления методом исключения можно ставить диагноз эндометриоз.

Хотя в настоящее время для диагностики эндометриоза необходимо проведение лапаротомии или лапароскопии (1), первичным скрининговым исследованием у бесплодных женщин в амбулаторных условиях может быть биопсия эндометрия. СА-125 - серологический маркер, показывающий прогрессирование эндометриоза, однако он бесполезен в первичной диагностике из-за своей низкой чувствительности (2).

Настоящее исследование впервые обосновало использование определения экспресии ароматазы цитохрома Р450 для диагностики эндометриоза. Однако в методологической его части есть несколько спорных пунктов. Во-первых, исследовано небольшое число образцов ретроспективно, необходимо контролируемое проспективное исследование. Во-вторых, в настоящем исследовании ПЦР-анализ ароматазы цитохрома Р450 был менее чувствительным, хотя и более легко осуществим. Иммуногистохимический анализ рассматривается как менее объективный и допускающий индивидуальные отклонения, однако наши антитела оказались достаточно чувствительными и специфичными для выявления ароматазы.

Не выявилось различий коэффициента Н в образцах, полученных в пролиферативную и секреторную фазы цикла. В образцах с эндометриозом не было корреляции между коэффициентом Н и степенью эндометриоза, а также между коэффициентом Н и сывороточным уровнем СА-125. Наши исследования показали, что экспрессия ароматазы цитохрома Р450 может быть не связана с прогрессированием энодметриоза. Механизм экспрессии ароматазы цитохрома Р450 при эндометриозе, аденомиозе и/или лейомиоме требует дальнейшего изучения. Хотя у этих патологий отдельный патогенез, они все являются эстроген-зависимыми. Ароматаза цитохрома Р450 также экспрессируется в эктопических эндометриоидных участках (8,9), ткани аденомиоза (9-11) и лейомиомы (12, 13). В стимуляции ароматазы может играть роль простагландин Е2 (25).

Заключение

Экспрессия ароматазы цитохрома Р450 в образцах эндометрия облегчает диагностику эндометриоза, аденомиоза, лейомиомы матки с высокой чувствительностью и специфичностью. Эта техника может использоваться при диагностике бесплодия амбулаторно в качестве первичного скрининга на присутствие эстроген-зависимых заболеваний.

 

Перевод Малярской М.М.

Читайте также:

Щитовидная железа, недостаток йода

Экстренная, посткоитальная, аварийная контрацепция

Эрозия шейки матки

Юность: гормональный бунт 14-18 лет

Язвы (во влагалище)

HELLP-синдром

Soor

Потеря обоняния

Паникулит

парапроаденинэмия

Конфликт крови

Патология век

Перелет, путешествие

Правовые вопросы

Простатит

Порок сердца

Псориаз

Препараты иммуноглобулинов

Психологическая помощь

Потеря сознания, обморок

Проблемы после родов

Рахит

Рентгенография: легких, черепа

 

Поделиться или сохранить себе

Статьи
Лекарства
Безопасность лекарств

Рубрикатор по Мед2000.ru

Анализы

Акушерство

Аллергология

Андрология

Гастроэнтерология

Гематология

Гинекология

Дерматология

Диетология

Иглотерапия

Иммунология

Инфекции

Кардиология

Косметология

Неврология

Нефрология

Онкология

Оториноларингология (ЛОР)

Паразитология

Педиатрия

Психиатрия

Психология

Пульмонология

Ревматология

Сексология

Стоматология

Терапия

Урология

Фармакология

Хирургия

Эндокринология

Эпидемиология

Другие специальности

 

Энциклопедии

Вопросы и ответы

Анализы. Инфекции

Аллергии

Здоровый человек

Атопический дерматит

Секс

Термины

Материалы ВОЗ

Нетрадиционные методы

Сам себе 03

Прививки

Косметика

 

Лекарства

От А до Й

От К до Н

От О до С

От Т до Я

 

Психология

Рецепты

 

Врачу

Справочник врача

Научные статьи, тезисы, литобзоры, методички

Переводы

Скорая помощь

 

Рубрикатор: Анализы, Акушерство, Аллергология, Андрология, Гастроэнтерология, Гематология, Гинекология, Дерматология, Диетология, Иглотерапия, Иммунология, Инфекции, Кардиология, Косметология, Неврология, Нефрология, Онкология, Оториноларингология (ЛОР), Паразитология, Педиатрия, Психиатрия, Психология, Пульмонология, Ревматология, Сексология, Стоматология, Терапия, Урология, Фармакология, Хирургия, Эндокринология, Другие специальности:, Анестезиология Ангиология, Гепатология, Наркология, Нейрохирургия, Неонатология Ортопедия, Офтальмология, Проктология, Реаниматология, Травматология, Фтизиатрия,

Сайт Библиотека Здоровья - Большая медицинская библиотека - www.med2000.ru (до 1999г - www.gabr.org) создан в 1998 году

©Med2000.ru, Gabr.org

Правила копирования информации с сайта Мед2000 для использования в Интернет

Представленная на сайте информация не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения и не может служить заменой очной консультации лечащего врача.

Страницу лучше просматривать при среднем размере шрифта